鈣離子膜通道鈉鈣交換體（NCX/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）功能熒光檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

（中文版）

主要用途

 鈣離子膜通道鈉鈣交換體（NCX/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）功能熒光檢測(cè)試劑是一種旨在使用選擇性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型鈣ATP酶、鈉鉀ATP酶和線粒體鈣泵抑制劑的條件下，通過(guò)鈣離子熒光探針，探測(cè)在ATP的激發(fā)下，進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子，而產(chǎn)生熒光增強(qiáng)，來(lái)分析和觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈉鈣交換體轉(zhuǎn)運(yùn)功能的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物、人體、真菌/酵母、植物等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈉鈣交換體活性的檢測(cè)，以及抑制劑篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

鈉鈣交換體（sodium-calcium exchanger；Na⁺-Ca⁺⁺ exchanger；NCX）是一種反向協(xié)同膜蛋白（antiporter membrane protein），常見(jiàn)于興奮細(xì)胞的細(xì)胞膜上和線粒體或內(nèi)置網(wǎng)上，使鈣離子排出胞漿外或進(jìn)入細(xì)胞器，通過(guò)移除1分子鈣離子，交換進(jìn)入3分子鈉離子，達(dá)到細(xì)胞鈣離子微環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡，以控制神經(jīng)分泌、光敏受體活性、心肌松弛、以及興奮-收縮偶聯(lián)等功能。鈉鈣交換體和鈣ATP酶不同，其與鈣離子的親和力低。鈉鈣交換體有5種異構(gòu)體：NCX1、NCX2、NCX3、NCX-SQ1、CALX。鈉鈣交換體異常與心肌缺血-再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury）有關(guān)。KB R7943、SEA0400和SN-6等是鈉鈣交換體選擇性抑制劑，具有治療心肌缺血、心律失常、心衰和高血壓的藥理價(jià)值。Mag-Fluo--AM染料是一種鈣離子低親和性的熒光標(biāo)記染料，特異性地由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)捕獲，可以檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的游離鈣離子濃度的變化，進(jìn)而分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈉鈣交換體的作用模式，監(jiān)測(cè)鎂ATP誘導(dǎo)的鈣離子攝入，來(lái)評(píng)價(jià)鈉鈣交換體的功能。其基本檢測(cè)步驟是，首先引入熒光探針到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其次膜通透處理后，同步加入線粒體鈣泵抑制劑FCCP、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型鈣ATP酶抑制劑毒胡蘿卜素（thapsigargin；TG）、鈉鉀ATP酶抑制劑烏本苷（ouabain）和Mg-ATP，在熒光分光光度儀下（激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)525nm）觀察熒光峰值的變化。 

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 染色液A（Reagent B1）  10毫升

 染色液B（Reagent B2） 100微升

 通透液（Reagent C） 200微升

 鈣化液（Reagent D）  20毫升

 攝鈣液（Reagent E） 100微升

 誘導(dǎo)液（Reagent F） 200微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)   1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融； 染色液B（Reagent B2）避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（  12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（  12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

恒溫水槽或培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

100微升比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 開(kāi)啟并設(shè)定好熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀（溫度為22℃）：激發(fā)波長(zhǎng)為490nm，散發(fā)波長(zhǎng)525nm，間隔30秒測(cè)讀1次，或動(dòng)態(tài)測(cè)讀，并置零
• 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑置于室溫下凍融預(yù)熱，避免光照。然后進(jìn)行下列操作

• 熒光測(cè)定

• 間接法

• 準(zhǔn)備1個(gè)25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞，鋪滿率達(dá)70％（1 X 10⁶細(xì)胞數(shù)）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入3毫升  清理液（Reagent A），覆蓋細(xì)胞表面
• 小心抽去 清理液（Reagent A） 
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿細(xì)胞表面
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育1分種
• 輕輕抖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 加入3毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g（注意：懸浮細(xì)胞可以從這一步開(kāi)始操作）
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 染色液（Reagent B），混勻細(xì)胞顆粒群
• 加入5微升 染色液B（Reagent B2），混勻
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 加入10微升 通透液（Reagent C）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育4分鐘（注意：這一步驟決定zui大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池濃度讀數(shù)；必要時(shí)可以調(diào)整孵育時(shí)間，既不能過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，又不能過(guò)短，導(dǎo)致通透不足）
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 鈣化液（Reagent D），混勻細(xì)胞顆粒群
• 室溫下孵育5分鐘
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為600g
• 小心抽去上清液
• 加入500微升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 分別移取100微升到5個(gè)100微升比色皿或黑色96孔板的4個(gè)孔，標(biāo)記為背景、誘導(dǎo)鈣攝入、*鈣攝入、待測(cè)抑制劑
• 按下表分別加入

• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀，動(dòng)態(tài)測(cè)讀3分鐘
• 獲得相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 分析結(jié)果

• （誘導(dǎo)鈣攝入RFU—背景RFU）：熒光差值越高，表明NCX轉(zhuǎn)運(yùn)功能活性越強(qiáng)
• 【（誘導(dǎo)鈣攝入RFU—背景RFU）÷（*鈣攝入RFU—背景RFU）】X 100%=誘導(dǎo)鈣攝入百分率：百分率越高，表明NCX轉(zhuǎn)運(yùn)功能活性越強(qiáng)
• 構(gòu)建轉(zhuǎn)運(yùn)曲線：縱座標(biāo)（Y）為鈣攝入相對(duì)熒光單位（RFU），橫座標(biāo)（X）為時(shí)間（秒）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
• 構(gòu)建抑制曲線：縱座標(biāo)（Y）為熒光差值RFU，橫座標(biāo)（X）為抑制劑濃度（微摩爾）
• 根據(jù)上述曲線，計(jì)算IC50（50％抑制率所需的抑制劑濃度）

二、 直接法

• 準(zhǔn)備1個(gè)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中4個(gè)孔的待測(cè)細(xì)胞，鋪滿率達(dá)70％（5 X 10⁴細(xì)胞數(shù)/孔），分別標(biāo)記為背景、誘導(dǎo)鈣攝入、*鈣攝入、待測(cè)抑制劑
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 小心加入200微升  清理液（Reagent A） 
• 小心抽去 清理液（Reagent A） 
• 小心加入100微升 染色液（Reagent B） 
• 小心加入1微升 染色液B（Reagent B2）
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去染色液
• 加入200微升 清理液（Reagent A） 
• 加入2微升 通透液（Reagent C）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育4分鐘（注意：這一步驟決定zui大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池濃度讀數(shù)；必要時(shí)可以調(diào)整孵育時(shí)間，既不能過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，又不能過(guò)短，導(dǎo)致通透不足）
• 小心抽去通透液
• 加入100微升 鈣化液（Reagent D） 
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去鈣化液
• 加入200微升 清理液（Reagent A） 
• 按下表分別加入

• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀，動(dòng)態(tài)測(cè)讀3分鐘
• 獲得相對(duì)熒光讀數(shù)（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 分析結(jié)果
  • （誘導(dǎo)鈣攝入RFU—背景RFU）：熒光差值越高，表明NCX轉(zhuǎn)運(yùn)功能活性越強(qiáng)
  • 【（誘導(dǎo)鈣攝入RFU—背景RFU）÷（*鈣攝入RFU—背景RFU）】X 100%=誘導(dǎo)鈣攝入百分率：百分率越高，表明NCX轉(zhuǎn)運(yùn)功能活性越強(qiáng)
  • 構(gòu)建轉(zhuǎn)運(yùn)曲線：縱座標(biāo)（Y）為鈣攝入相對(duì)熒光單位（RFU），橫座標(biāo)（X）為時(shí)間（秒）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)8）
  • 構(gòu)建抑制曲線：縱座標(biāo)（Y）為熒光差值RFU，橫座標(biāo)（X）為抑制劑濃度（微摩爾）
  • 根據(jù)上述曲線，計(jì)算IC50（50％抑制率所需的抑制劑濃度）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 孵育時(shí)，避免光照
• 直接法，細(xì)胞換液時(shí)，避免使細(xì)胞脫落；如果細(xì)胞貼壁較松，建議使用間接法
• 可以進(jìn)行動(dòng)態(tài)或定時(shí)熒光檢測(cè)分析
• 用戶進(jìn)行抑制劑篩選，建議使用濃度梯度
• 可以使用NCX抑制劑毒BENZAMIL作為抑制劑對(duì)照
• 鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)曲線參考圖像如下：

                                       ∣基礎(chǔ)∣   鈣攝入曲線  ∣

• 本公司提供系列鈣離子膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)功能（transport/uptake）分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰