MX10362.1 v.A

  細胞膜流動性（fluidity）PDA熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  細胞膜流動性（fluidity）PDA熒光檢測試劑是一種旨在通過苯并芘癸酸熒光染料，選擇性地與細胞膜整合，并與之產(chǎn)生空間交互作用，形成激基締合物，其熒光散發(fā)波長的轉移，即熒光比值的增強或減弱，來分析膜流動性的而經(jīng)典的技術方法。該技術經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種人體或動物貼壁或懸浮細胞膜流動性的動力學檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，活體檢測，操作簡易，性能穩(wěn)定。

技術背景

細胞膜和細胞質微管以及微絲的動力學特征和微泡和囊泡內脂質的流動動力學，即流變學（rheological）細胞功能，受到細胞膜流動性（fluidity）或粘性（viscosity）調節(jié)，包括細胞膜酶系的活化，微管和微絲的特定裝配或流動，化學引誘物受體親和力的強化，膜結構和功能的作用等。一旦調節(jié)失衡，會導致病理演變或膜性變異。苯并芘癸酸（pyrenedecanoic acid；PDA）為多環(huán)芳香烴（polycyclic aromatic hydrocarbon）化合物，一種親脂性苯并芘熒光探針染料，用于膜生物物理學研究：一，具有親脂性； 第二，與細胞膜脂質具有類似性（analog），可以與細胞膜整合；第三，進入膜結構空間后，與之產(chǎn)生交互作用，形成激基締合物（eximer），其熒光散發(fā)波長由372nm轉移到470nm，通過締合物和單體的熒光比值（ratio），分析膜流動性強弱，包括動力學，影響因子等。  

產(chǎn)品內容

  染色液（Reagent A）            微升

  稀釋液（Reagent B）            毫升

  清理液（Reagent C）            毫升

  強化液（Reagent D）            微升

產(chǎn)品說明書               1份

保存方式

保存  清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；  染色液（Reagent A）避免光照；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細胞脫離操作

細胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細胞脫落操作

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺式離心機：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光定性分析

比色皿或黑色96孔板：用于熒光定量分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標儀：用于熒光定量分析

細胞流式儀：用于熒光分析

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，  稀釋液（Reagent B）和  強化液（Reagent D）放進25℃恒溫水槽里預熱。然后分別移出xx微升  染色液（Reagent A）和xx微升  強化液（Reagent D）到新的1.5毫升離心管，加入980微升  稀釋液（Reagent B），混勻后，在冰槽里靜置（共5次操作量），并標記為  染色工作液，放在暗室里。然后進行下列操作。

一、直接法

1． 準備1個96孔細胞培養(yǎng)板的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約1 X 10⁵細胞數(shù)）

2． 小心抽去細胞培養(yǎng)液

3． 輕輕沿著孔壁加入xx微升   清理液（Reagent C）到細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． 小心抽去  清理液（Reagent C）

5． 加入xx微升含有  染色液（Reagent A）、  稀釋液（Reagent B）和  強化液（Reagent D）的  染色工作液，覆蓋培養(yǎng)孔表面

6． 放進25℃細胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）

7． 小心抽去  染色工作液

8． 小心加入xx微升  清理液（Reagent C）

9． 小心抽去  清理液（Reagent C）

10． 重復實驗步驟8至9一次

11． 小心加入xx微升  清理液（Reagent C）

12． 選擇下列檢測：

一、 即刻在倒置熒光顯微鏡下進行觀察

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長370nm，干涉濾波器405nm波長 ）――可見淺藍色熒光；如果強度明顯，表明膜流動性減弱

2） 激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長470nm）――可見深藍色熒光；如果強度顯著減弱，表明膜流動性減弱

二、即刻在熒光酶標儀檢測（激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長370nm和470nm）：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）以及RFU470/RFU370的比值：比值高，膜流動性強

二、間接法

1． 準備1個12孔細胞培養(yǎng)板的待測細胞，每孔鋪滿率達70％（約2 X 10⁶細胞數(shù)）

2． 小心抽去細胞培養(yǎng)液

3． 加入xx毫升   清理液（Reagent C）到細胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面

4． 小心抽去xx毫升   清理液（Reagent C）

5． 加入500微升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個培養(yǎng)孔表面

6． 置入37℃培養(yǎng)箱1分種

7． 輕輕抖動培養(yǎng)板，使細胞脫落，然后加入1毫升用戶自備的細胞培養(yǎng)液

8． 移入1.5毫升離心管（注意：懸浮細胞從這一步開始）

9． 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為1000g

10． 小心抽去上清液

11． 加入xx微升含有  染色液（Reagent A）、  稀釋液（Reagent B）和  強化液（Reagent D）的  染色工作液

12． 用200微升槍頭上下輕柔抽吸，混勻細胞顆粒群

13． 放進25℃細胞培養(yǎng)箱里，孵育20分鐘（注意避光）

14． 放進微型臺式微型離心機離心5分鐘，速度為1000g

15． 小心抽去上清液

16． 加入xx微升  清理液（Reagent C），混勻細胞顆粒群

17． 放進微型臺式微型離心機離心5分鐘，速度為1000g

18． 小心抽去上清液

19． 重復實驗步驟16至18一次

20． 加入xx微升  清理液（Reagent C），混勻細胞顆粒群

21． 進行下列檢測

選擇一、（共聚焦）熒光顯微鏡觀察 

1． 混勻后，移出50微升在載玻片上

2． 即刻進行載玻片壓片，在熒光顯微鏡下進行觀察：

1） 單體熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長370nm，干涉濾波器405nm波長 ）――可見淺藍色熒光；如果強度明顯，表明膜流動性減弱

2）激基締合物（eximer）熒光（二向色性濾波器激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長470nm）――可見深藍色熒光；如果強度顯著減弱，表明膜流動性減弱

選擇二、細胞流式儀分析

1. 混勻后，即刻進行細胞流式儀分析：觀察5000個細胞以上

選擇三、熒光分光光度儀或熒光酶標儀測定

1． 混勻后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里

2． 即刻進行熒光分光光度儀或熒光酶標儀測定（激發(fā)波長350nm，散發(fā)波長370nm和470nm）：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）以及RFU470/RFU370的比值：比值高，膜流動性強

注意事項

1． 本產(chǎn)品為20次（0.2毫升工作液）操作

2． 操作時，須戴手套

3． 待測細胞建議不要過于饑餓或過度生長

4． 操作時，避免污染母液，尤其是  稀釋液（Reagent B）

5． 建議細胞染色完成后，即刻進行熒光檢測分析

6． 孵育時，避免光照

7． 本公司提供系列膜流動性檢測試劑產(chǎn)品

質量標準

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰