MX50047.3.1 v.A
細(xì)胞組織蛋白酶B(CATHEPSIN B)活性熒光定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書
(中文版)
主要用途
細(xì)胞組織蛋白酶B(CATHEPSIN B)活性熒光定量檢測試劑是一種旨在通過二肽化合物底物z-FR-AMC,在組織蛋白酶L抑制劑的存在下,受到組織蛋白酶B的水解,釋放出熒光產(chǎn)物氨甲基,即采用熒光法來測定細(xì)胞裂解萃取樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品(動物、人體、植物、昆蟲等)組織蛋白酶B(CATHEPSIN B)的特異活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
組織蛋白酶(CATHEPSIN),是一種木瓜酶(papain)類半胱氨酸或天冬氨酸蛋白酶(Cysteine or Aspartic protease),普遍存在于溶酶體細(xì)胞器內(nèi),在酸性環(huán)境下激活,切離各種目標(biāo)蛋白。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和底物特異性,組織蛋白酶家屬約有十多種成員,包括A、B、C、D、E、G、H、K、L、S等。組織蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞外蛋白通過內(nèi)吞進(jìn)行周轉(zhuǎn)中起著重要作用,同時(shí)也是啟動和傳遞細(xì)胞凋亡信號的替代機(jī)制,以及腫瘤和炎癥性組織損傷的病理生理變化。其中組織蛋白酶B(EC 3.4.22.1),又稱為CTSB,作為溶酶體的標(biāo)志性酶蛋白,可以使β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein)轉(zhuǎn)化為β-淀粉樣蛋白斑點(diǎn)(β-amyloid plaque)在抗原處理(antigen processing)、腫瘤轉(zhuǎn)移、骨再吸收、細(xì)胞內(nèi)或分泌性調(diào)節(jié)蛋白周轉(zhuǎn)、卵細(xì)胞成熟、細(xì)胞凋亡等方面具有重要作用。細(xì)胞間接觸和細(xì)胞外基質(zhì)成分影響43kd組織蛋白酶原L轉(zhuǎn)化為成熟蛋白。組織蛋白酶B使膠原蛋白、結(jié)締組織蛋白、β-淀粉樣前體蛋白等降解。與半胱氨酸蛋白酶抑制劑A和B(Cystatin A和B)、S100A10等蛋白相互反應(yīng)。組織蛋白酶B異常,將導(dǎo)致阿茨罕默綜合癥(Alzheimer's disease)、食道腫瘤(esophageal adenocarcinoma)等疾患。基于人工合成的二肽化合物底物z-FR-AMC(z-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin;乙酰苯丙氨酰精氨酰氨甲基),在組織蛋白酶L抑制劑Z-FY(t-Bu)-DMK的存在下,受到組織蛋白酶B的水解,釋放出熒光7-氨基-4-甲基(7-amido-4-methylcoumarin;激發(fā)波長360nm;散發(fā)波長460nm),來定量測定組織蛋白酶B的特異活性。組織蛋白酶B反應(yīng)系統(tǒng)為:
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
緩沖液(Reagent C) 毫升
底物液(Reagent D) 微升
標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E) 微升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存 清理液(Reagent A)在4℃冰箱里;其余的保存在-20℃冰箱里; 底物液(Reagent D)和 標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E)避免光照和反復(fù)凍融;有效保證6月
用戶自備
1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器
細(xì)胞刮脫棒:用于脫離貼壁細(xì)胞
微型臺式離心機(jī):用于樣品沉淀
培養(yǎng)箱:用于反應(yīng)物孵育
96孔板或比色皿:用于樣品熒光測定的容器
熒光酶標(biāo)儀或熒光分光光度儀:用于樣品熒光分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 樣品制備
1. 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞(1至5 X 106細(xì)胞)
2. 小心加入xx毫升 清理液(Reagent A),覆蓋生長表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入xx毫升 清理液(Reagent A),混勻細(xì)胞
6. 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意:懸浮細(xì)胞從這一步驟開始)
7. 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升 裂解液(Reagent B),充分混勻
10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
11. 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
12. 置于冰槽里孵育30分鐘
13. 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14. 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
15. 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1)
16. 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、 測定準(zhǔn)備
1. 準(zhǔn)備好待測樣品(例如細(xì)胞裂解萃取液樣品等),置于冰槽里
2. 設(shè)定好熒光分光光度儀(溫度為37℃):激發(fā)波長360nm,散發(fā)波長460nm,并置零
3. 準(zhǔn)備好5個1.5毫升離心管,標(biāo)記為1至5號管
4. 分別加入xx微升 緩沖液(Reagent C)到2至5號管
5. 移取xx微升 標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E)到1號管,混勻
6. 小心移取xx微升1號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E)到2號管,混勻
7. 小心移取xx微升2號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E)到3號管,混勻
8. 小心移取xx微升3號管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E)到4號管,混勻
9. 將1至5號管放進(jìn)冰槽里備用,避免光照;標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表
管號 | 緩沖液(Reagent C) | 標(biāo)準(zhǔn)液(Reagent E) | 標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度 |
1 | xx微升 | xx微摩爾/升 | |
2 | xx微升 | xx微升1號管 | xx微摩爾/升 |
3 | xx微升 | xx微升2號管 | xx微摩爾/升 |
4 | xx微升 | xx微升3號管 | xx微摩爾/升 |
5 | xx微升 | 0 | 0 |
三、 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定
1. 移取xx微升 緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升 底物液(Reagent D)
3. 加入xx微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在37℃溫度下孵育60分鐘
6. 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測:獲得相對熒光讀數(shù)(Relative Fluorescence Unit;RFU)
7. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至6四次
8. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為相對熒光單位(RFU);橫座標(biāo)(X軸)為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度(微摩爾/升)
四、 樣品測定
1. 移取xx微升 緩沖液(Reagent C)到新的比色皿
2. 加入xx微升 底物液(Reagent D)
3. 加入10微升待測樣品(50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白)(注意:樣品須清澈)
4. 上下傾倒數(shù)次,混勻
5. 在37℃溫度下孵育60分鐘
6. 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測:獲得樣品相對熒光讀數(shù)(Relative Fluorescence Unit;RFU)
7. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)AMC濃度
五、 計(jì)算樣品實(shí)際活性
六、 酶標(biāo)儀測定
1. 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記:標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品
2. 分別移取xx微升 緩沖液(Reagent C)到相應(yīng)孔里
3. 分別加入xx微升 底物液(Reagent D)
4. 分別加入10微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測樣品(50微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白)(注意:樣品須清澈)
5. 輕輕搖動96孔板
6. 在37℃溫度下孵育60分鐘
7. 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測:獲得相對熒光讀數(shù)
8. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線:縱座標(biāo)(Y軸)為相對熒光單位;橫座標(biāo)(X軸)為標(biāo)準(zhǔn)AMC濃度(微摩爾/升)
9. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品對應(yīng)AMC濃度
10. 樣品實(shí)際活性計(jì)算:
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品為20次操作
2. 操作時(shí),須戴手套
3. 系統(tǒng)操作過程中,標(biāo)準(zhǔn)曲線測定只需1次
4. 樣品須澄清,且避免反復(fù)凍融
5. 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/10微升(本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1)
6. 如果待測樣品濃度過高或過低,可以調(diào)整樣品濃度
7. 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定
8. 可以使用組織蛋白酶B抑制劑CA-074作為抑制劑對照或陰性對照
9. 組織蛋白酶B單位活性定義為:在37℃,pH 5.5條件下,每分鐘內(nèi)能夠切離1微摩爾二肽化合物底物z-FR-AMC所需的酶量作為一個活性單位
10. 本公司提供系列組織蛋白酶學(xué)檢測試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感
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