組織甘油-3-磷酸脫氫酶-II 活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）
主要用途
組織甘油-3-磷酸脫氫酶-II（Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase-II）活性比色法定量檢測(cè)試劑是
一種旨在使用合成電子受體染料，通過反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定染料還原后峰值的變化，即采用比色法測(cè)算樣品中酶
活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種動(dòng)物、人體組織裂
解懸液樣品的甘油-3-磷酸脫氫酶-II 的性活性檢測(cè)。可用于脂類代謝、能量代謝等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋
白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。
技術(shù)背景
甘油-3-磷酸脫氫酶（Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase；GPDH），又稱為α-甘油-3-磷酸脫氫酶（α-
glycerol-3-phosphate dehydrogenase；α-GPDH），催化糖酵解通路中產(chǎn)生的磷酸二羥丙酮（Dihydroxyacetone
phosphate）還原為sn-甘油-3-磷酸（sn-glycerol 3-phosphate）反應(yīng)的酶，存在于在動(dòng)物、植物、酵母、細(xì)菌
中，尤其存在于人體的肌肉組織和脂肪細(xì)胞里。其功能在于參與甘油代謝，同時(shí)連接糖酵解和磷脂、甘油
三酯代謝通路在一起，完成脂類和細(xì)胞壁的合成，以及能量供給、信號(hào)傳導(dǎo)、分解代謝和呼吸鏈電子傳遞
等作用。甘油-3-磷酸脫氫酶分為I型和II型：I型為胞漿型NAD依賴性甘油-3-磷酸脫氫（Cytoplasmic NAD+-
Dependent Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase或GPDH-NAD+ 2-oxidoreductase；EC1.1.1.8），II型為線粒體
型FAD依賴性甘油-3-磷酸脫氫（Mitochondrial FAD-Dependent Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase或acceptor
oxidoreduxtase；EC1.1.99.5）。I型和II型是聯(lián)合作用的：即I型通過NADH的氧化消耗，由磷酸二羥丙酮，獲
得sn-甘油-3-磷酸，后者通過線粒體外膜，進(jìn)入線粒體，受到II型的重新氧化為磷酸二羥丙酮，回到胞漿里，
同時(shí)產(chǎn)生ATP能量。其中II型是呼吸鏈電子傳遞的主要脫氫酶之一，在氧化甘油-3-磷酸的同時(shí)，還原輔酶黃
素腺嘌呤二核苷酸（Flavin Adenine Dinucleotide；FAD）為還原型黃素腺嘌呤二核苷酸（Reduced Flavin
Adenine Dinucleotide；FADH2），同時(shí)傳遞電子到泛醌（ubiquinone；UQ）分子，終傳遞到氧分子上?；?br />于底物甘油-3-磷酸，在輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸的存在下，受到甘油-3-磷酸脫氫酶-II的催化，氧化產(chǎn)生磷
酸二羥丙酮，進(jìn)而通過使用人工電子受體染料二甲基噻唑二苯基四唑嗅藍(lán)（3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-
2,5-diphenyl-tetrazolium bromide；MTT），簡稱噻唑鹽染料，接受來自還原型黃素腺嘌呤二核苷酸的電子，
而被還原，產(chǎn)生吸光峰值（570nm波長）的變化，來測(cè)算甘油-3-磷酸脫氫酶II的活性。其反應(yīng)方式為：
GPDH-II
glycerol-3-phosphate + FAD + 4H+ → Dihydroxyacetone phosphate + FADH2 + 2H+
Oxidized MTT/UQ + FADH2 → Reduced MTT/UQH2 + FAD + 2H＋
產(chǎn)品內(nèi)容
裂解液（Reagent A） 毫升
強(qiáng)化液（Reagent B） 毫升
緩沖液（Reagent C） 毫升
反應(yīng)液（Reagent D） 毫升
陰性液（Reagent E） 毫升
2
底物液（Reagent F） 毫升
產(chǎn)品說明書 1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；底物液（Reagent F），避免光照，有效保證6 月
用戶自備
1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作
比色皿：用于比色分析的容器
分光光度儀：用于比色分析
培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；底物液（Reagent F）注
意避光。然后進(jìn)行下列操作。
一、 樣品準(zhǔn)備
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定100 毫克組織重量
2． 移入到一個(gè)液氮凍存管
3． 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
4． 次日從液氮罐里取出，即刻（快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
5． 放進(jìn)一個(gè)15 毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的X 毫升裂解液（Reagent A）
7． 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
8． 在冰槽里孵育2 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒一次
9． 加入X 微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent B）
10．渦旋震蕩5 秒，充分混勻
11．在冰槽里孵育5 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒二次
12．放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10 分鐘，速度為10000g
13．小心抽去上清液
14．加入X 微升緩沖液（Reagent C），混勻線粒體顆粒群
15．移取10 微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意： Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－
30030.1 ）
16．即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
二、測(cè)定準(zhǔn)備
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，置于冰槽里
3
2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為570nm，間隔1 分鐘，讀數(shù)11 次（共10 分鐘），并置零
三、 背景對(duì)照測(cè)定
1． 移取X 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入X 微升反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入X 微升底物液（Reagent F）
4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育5 分鐘
5． 加入X 微升陰性液（Reagent E）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照：570 波長讀數(shù)10 分鐘 －570 波長讀數(shù)0 分鐘
四、 樣品活性測(cè)定
1． 移取X 微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入X 微升反應(yīng)液（Reagent D）
3． 加入X 微升底物液（Reagent F）
4． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里孵育5 分鐘
5． 加入X 微升待測(cè)樣品（注意：100 微克線粒體蛋白）
6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3 秒之內(nèi)）
7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品活性讀數(shù)：570 波長讀數(shù)10 分鐘 －570 波長讀數(shù)0 分鐘
五、 計(jì)算樣品活性
【（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 1（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數(shù)】÷【0.05（樣品容量；毫升）X 17（毫
摩爾吸光系數(shù) X 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾MTT/分鐘
六、 酶標(biāo)板測(cè)定
1． 在96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照和樣品
2． 分別移取X 微升緩沖液（Reagent C）到96 孔板中的所有孔中
3． 分別加入X 微升反應(yīng)液（Reagent D）
4． 分別加入X 微升底物液（Reagent F）
5． 輕輕搖動(dòng)96 孔酶標(biāo)板
6． 在30℃溫度下孵育5 分鐘
7． 分別加入X 微升陰性液（Reagent E）或待測(cè)樣品（50 微克線粒體蛋白）到相應(yīng)孔中（注
意：樣品須清澈）
8． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板
9． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
10．活性計(jì)算
[（樣品讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù)X 0.25（體系容量；毫升）]÷[0.0125（樣品容量；毫升）X 17（毫
4
摩爾吸光系數(shù)）X 0.6（厘米）X 10（分鐘）]＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克
單位＝微摩爾MTT/分鐘
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為21 次操作，包括1 次背景對(duì)照
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1 次
4． 加入樣品后3 秒內(nèi)即刻比色測(cè)定
5． 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可以持續(xù)10 分鐘
6． 測(cè)定值由低到高變化，即10 分鐘測(cè)定讀數(shù)高于0 分鐘測(cè)定讀數(shù)，表明有酶活性
7． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
8． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100 微克/50 微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；
注意計(jì)算公式的調(diào)整（本公司提供 Bradford蛋 白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1 ）
9． 甘油-3-磷酸脫氫酶-II 活性單位定義：在30℃溫度下，pH 7.4 條件下，每分鐘內(nèi)能夠還原1 微摩爾二甲
基噻唑二苯基四唑嗅藍(lán)（MTT）所需的酶量作為一個(gè)活性單位
10．本公司提供系列甘油-3-磷酸脫氫酶類技術(shù)產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確