銘修（上海）實(shí)驗(yàn)室淺談如何選擇合適的光源獲得的熒光成像

熒光顯微鏡是利用特定波長的激發(fā)光照射被檢物體產(chǎn)生熒光進(jìn)行鏡檢的顯微光學(xué)觀測技術(shù)，已有100多年歷史。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都有配備或者常規(guī)的顯微成像系統(tǒng)，熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。 細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。

近年來，各種新型熒光染料及各種專業(yè)化的熒光探針不斷出現(xiàn)，例如：熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）相關(guān)試劑盒，市場上出現(xiàn)的探針就有十?dāng)?shù)種之多，Vysis mFISH探針試劑盒（FITC,CY5，TxR, DEAC,SP-Gold）, Abbott-FISH探針試劑盒(Spectrum Blue,Spectrum Aqua,Spectrum Green,Spectrum Gold,Spectrum Orange),Zytovision FISH (ZyBlue,DAPI,ZyGreen), Cytocell FISH探針試劑盒，其染料的譜線范圍各有差異，如何進(jìn)行配置合適的熒光顯微鏡以獲得*的熒光檢測效果成為一個(gè)較為復(fù)雜的問題。廣州科適特科學(xué)儀器有限公司一直致力于為客戶提供定制化的熒光顯微鏡成像系統(tǒng)，根據(jù)客戶的反饋和我們自身的工作實(shí)踐簡單總結(jié)一下如何選擇合適的光源以獲得的熒光效果。

一.熒光顯微鏡簡要原理

熒光顯微鏡的基本構(gòu)造通常由普通光學(xué)顯微鏡再加一些如熒光光源 、激發(fā)濾片、雙色束分離器及阻斷濾片等附件的基礎(chǔ)上組成。同時(shí)采用的熒光光源一般為超高壓汞燈，它可發(fā)出各種波長的光，且每種熒光物質(zhì)都會(huì)有一個(gè)產(chǎn)生zui強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長 ，這時(shí)需加置激發(fā)濾片，通常有紫外、紫色、藍(lán)色及綠色激發(fā)濾片，僅需使一定波長的激發(fā)光透過并照射到標(biāo)本上，并將其他光都吸收掉。

二．影響到熒光顯微鏡成像效果的因素

影響熒光顯微鏡成像的熒光因素很多，主要包括：熒光樣品的制備，熒光光源的選擇，濾片轉(zhuǎn)盤的設(shè)計(jì)，熒光濾片的組合策略（激發(fā)光濾片，發(fā)射光濾片，雙色鏡分光濾片，帶寬選擇），顯微鏡物鏡種類，顯微鏡攝像系統(tǒng)的選擇等問題。熒光的激發(fā)、濾光、成像、淬滅，熒光實(shí)驗(yàn)的調(diào)整就是怎么才能協(xié)調(diào)好以上因素得到*的效果，其中影響到成像效果的一個(gè)重要因素即是熒光光源。

三．熒光顯微鏡光源種類及介紹

熒光顯微鏡的常用光源通常都是白光光源：高壓汞燈，氙燈，金屬鹵素?zé)艉蚅ED白光光源以及的LED單波長光源。

1、汞燈
超高壓汞燈（50-200W），它是用石英玻璃制作，中間呈球形，內(nèi)充一定數(shù)量的汞，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起汞蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)汞*蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50～70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使汞分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。推薦產(chǎn)品：歐司朗50W，103W，200W汞燈，適用于各大廠家熒光顯微鏡；一般200小時(shí)壽命。

2、氙燈
氙燈和汞燈做為白光源，都能提供從紫外到近紅外一系列波長的光，但它們卻有著不同的激發(fā)光譜。汞燈集中在近紫外、藍(lán)光以及綠光附近，這種在峰值的高激發(fā)能量確保產(chǎn)生明亮的熒光信號，但光毒性卻很強(qiáng)。因此，HBO用來對固定樣品或弱熒光成像。相比而言，氙燈光源的激發(fā)比較平緩，可以用于不同波長間強(qiáng)度的比較，例如用于鈣離子濃度測量等。氙燈的強(qiáng)激發(fā)在近紅外800-1000nm。

XBO較HBO的特點(diǎn)：
1）光譜強(qiáng)度更均勻
2）在紅外及中紅外仍有較強(qiáng)光譜強(qiáng)度
3）能量較強(qiáng)更易到達(dá)物鏡后孔徑
此類產(chǎn)品：XBO75W，100W氙燈；壽命一般400小時(shí)，1200小時(shí)

3、金屬鹵素?zé)?/strong>
目前各大顯微鏡品牌廣泛使用的一種光源，它和汞燈的激發(fā)光譜很像，但它和顯微鏡以光纖相連，能散熱，壽命更長。光纖從光源連到顯微鏡上，可以大量減少光產(chǎn)生的熱能。金屬鹵素?zé)魧罴?xì)胞成像的另一個(gè)優(yōu)勢是內(nèi)置強(qiáng)度設(shè)計(jì)裝置，可以容易調(diào)節(jié)激發(fā)光。也可以通過選擇直接連接獲得更好的激發(fā)效果。例如：EXCELITAS公司X-cite光源，120W，適用于各大廠家熒光顯微鏡；壽命2000小時(shí)以上。廣州科適特科學(xué)儀器有限公司是此公司的授權(quán)代理商。 *，發(fā)貨速度快。

4、LED白光熒光光源
這種光源的開關(guān)在毫秒間，減少樣品在光照下的暴露時(shí)間，延長壽命。另外，LED光的衰減即快又，長期活細(xì)胞試驗(yàn)下可大大減少光毒性。和白光相比，LED僅僅在一個(gè)較窄的光譜激發(fā)，多個(gè)LED波段使得LED光源能為多色熒光提供應(yīng)用。例如：EXCELITAS公司X-cite 120LED/LED MINI光源，CoolLED熒光光源系列，PE 300 Lite/Ultra等系列?？梢圆捎貌迦胩囟V片及采用外部控制器并且提供SDK軟件用于二次開發(fā)，方便整合到熒光顯微鏡系統(tǒng)控制。

優(yōu)點(diǎn)：
·壽命長，衰減慢，通常不需要更換燈泡及校準(zhǔn)
·控制方便，通常配備有外部控制器
·能進(jìn)行特定波長開關(guān)，減少熒光串色及熒光淬滅。
·結(jié)合多色帶通濾片組的選擇可實(shí)現(xiàn)無轉(zhuǎn)盤設(shè)計(jì)，減少震動(dòng)。
缺點(diǎn)：
·光譜曲線的某些激發(fā)強(qiáng)度不如汞燈和金屬鹵化物光源，某些波段激發(fā)
·強(qiáng)度不夠。例如：CY7，DAPI染料強(qiáng)度比汞燈和金屬鹵化物燈弱。

光譜曲線對比

壽命對比，LED 25000小時(shí)以上

新產(chǎn)品：EXCELITAS公司2018年6月zui近新推出X-Cite® XYLIS LED光源，可以很好的解決這個(gè)問題，全光譜360nm-770nm, 覆蓋從DAPI到CY7的熒光染料，TRITC/TxRd/mCherry的熒光探針表現(xiàn)優(yōu)異，尤其適合FISH和體式熒光顯微鏡觀察。先進(jìn)的控制系統(tǒng)可以采用USB/TTL/SpeedDIAL控制，還可以采用腳踏板控制，操作方便。此光源UV LED部分還具有DAPI 365nm和385nm兩種型號，更加適合DAPI激發(fā)，并且具有UV-OFF模塊降低背景噪音，考慮周到！

輸出光譜強(qiáng)度比較

5.LED單波長熒光光源，此類光源屬于的熒光光源，價(jià)格昂貴，通常需要20000美元左右哦。采用單波長LED模塊設(shè)計(jì)，輸出單個(gè)波長的熒光譜線，例如365nm/488nm/561nm/633nm, 類似于激光光源。此類優(yōu)點(diǎn)突出；壽命長，采用光電快速切換，有效避免物理震動(dòng)。LED單模塊光源的單色性好，極大的降低了白光光源的背景噪音，激發(fā)。程序控制適合整合到的成像系統(tǒng)中。例如：EXCELITAS公司X-CITE TURBO系統(tǒng)，蔡司公司的Colibri LED光源即屬于此類代表，壽命普遍在幾千個(gè)小時(shí)。

四．總結(jié)

高靈敏度固態(tài)探測器，高數(shù)值孔徑物鏡和各種不斷開發(fā)出來的基于計(jì)算機(jī)圖像分析方法，幫助生物醫(yī)學(xué)研究者進(jìn)一步深入調(diào)查基于熒光的生物現(xiàn)象，讓研究者深入探究在自然環(huán)境中在活細(xì)胞內(nèi)。同時(shí)免疫熒光在醫(yī)學(xué)研究、診斷領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)ISH、各種熒光蛋白技術(shù)分別在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的推廣，生物醫(yī)學(xué)科研對儀器需要越來越高，先進(jìn)的的熒光儀器和配件的發(fā)展將毫無疑問地繼續(xù)。銘修（上海）生物科技有限公司參與其中，為此領(lǐng)域的發(fā)展貢獻(xiàn)微薄力量。